Il Nobel per la Chimica 2020 va, finalmente, a Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier, le due scienziate che per prime hanno messo a punto la tecnica rivoluzionaria di editing genomico CRISPR-Cas9, rendendo la pratica più semplice, rapida ed economica. Il premio detiene anche un primato: è la prima volta che nessun uomo entra fra i vincitori di un Nobel.
L’editing genomico è una pratica che rientra nella branca dell’ingegneria genetica di cui fa parte anche la terapia genica. Questi due tipi di approcci hanno una sostanziale differenza. Per terapia genica si intende il trasferimento di un gene funzionante all’interno di un organismo al fine di curare una patologia causata dall’assenza o dal difetto di uno o più geni mutati. Questo limita l’applicazione della tecnica ad alcuni tipi di malattie escludendo le patologie causate dal malfunzionamento del singolo gene. L’editing genomico interviene proprio in questo caso, permettendo la sostituzione, lo spegnimento, la modifica di un particolare gene mutato agendo in siti specifici.
Dal 2012, anno in cui è stato pubblicato su Science l’articolo delle ricercatrici Doudna e Charpentier, la ricerca su CRISPR-Cas9 è letteralmente esplosa. La potenza di questo nuovo metodo era evidente e tutti aspettavano il Nobel da un momento all’altro. Ma a differenza di tecniche di editing genomico precedenti, CRISPR-Cas9 è un sistema esistente in natura all’interno di alcuni tipi di batteri. Per questo motivo il metodo in sé non era brevettabile, ma poteva esserlo la sua applicazione ingegneristica.
A seguito della pubblicazione dell’articolo, Doudna e Charpentier si sono affrettate a depositare la richiesta di brevetto presso l’USPTO, l’ufficio brevetti statunitense. Ma, a pochi mesi di distanza, anche Feng Zhang del MIT di Boston ha sottomesso la medesima richiesta, rivendicando la paternità del metodo che ha permesso per la prima volta la possibilità di applicare CRISPR alle cellule umane. Dal quel momento partì il procedimento che si concluse inizialmente con la concessione del brevetto a Feng Zhang, anche se è del 16 gennaio 2020 la revoca definitiva del brevetto europeo da parte dell’European Patent Office.
Pertanto, i candidati premi Nobel per CRISPR non mancavano di certo. Stoccolma ha deciso di premiare le due ricercatrici che da più tempo si dedicavano alla ricerca sul metodo, riconoscendo il lavoro delle due donne che erano partite dalla ricerca di base.
“Emmanuelle Charpentier e Jennifer A. Doudna hanno scoperto uno degli strumenti più acuti della tecnologia genetica: le forbici genetiche CRISPR-Cas9. Usandoli, i ricercatori possono modificare il DNA di animali, piante e microrganismi con estrema precisione. Questa tecnologia ha avuto un impatto rivoluzionario sulle scienze della vita, sta contribuendo a nuove terapie contro il cancro e può realizzare il sogno di curare le malattie ereditarie.” – Comunicato ufficiale Premio Nobel per la Chimica 2020
Prima di arrivare al Nobel per la Chimica alla rivoluzionaria tecnica di CRISPR-Cas9, la storia dell’editing genomico ha visto protagonisti altri validi metodi. Già dai primi anni 2000 si parlava di editing genomico, quando le tecniche più popolari erano le nucleasi a dita di zinco e i TALEN.
Il primo strumento individuato sono state le nucleasi a dita di zinco (ZFN). LE ZFN sono delle proteine artificiali costruite in laboratorio con le tecniche del DNA ricombinante. Sono costituite da due porzioni distinte: una in grado di riconoscere e legarsi ad una sequenza precisa di DNA, l’altra è un enzima di restrizione in grado di tagliare la catena di DNA. Queste “forbici molecolari” vengono progettate in modo preciso per far sì che la coda riconosca e si leghi alla sequenza complementare di DNA di mio interesse.
Quando il DNA viene tagliato, la cellula mette in atto un sistema di autoriparazione dove entrano in gioco delle proteine che vanno a ricongiungere le due estremità. Però, il ricongiungimento viene fatto in modo casuale poiché le proteine adibite alla riscrizione del tratto di DNA non hanno lo “stampo” da cui formare la nuova porzione corretta. Perciò succede che quel gene non viene corretto ma silenziato (gene knockout). Se oltre alle ZNF forniamo un breve tratto di DNA con estremità complementari a quelle del taglio, la cellula sarà in grado di utilizzare questo DNA per riparare il danno alla doppia elica. In questo modo avremo una ricombinazione omologa con la correzione del gene.
I TALEN sono stati scoperti dopo le nucleasi a dita di zinco e seguono lo stesso concetto. Anche i TALEN sono enzimi ottenuti con le tecniche del DNA ricombinante, poiché come le ZNF non esistono in natura. Se però guardiamo la coda adibita al riconoscimento delle basi specifiche del DNA, quella dei TALEN risulta più precisa. Nelle ZNF ogni tratto riconosce una tripletta di basi (codone), mentre i TALEN hanno un residuo atto a riconoscere un singolo nucleotide. Il riconoscimento è molto più preciso, riducendo il rischio di commettere un errore nell’appaiamento e di tagliare il DNA in un punto indesiderato.
La storia di CRISPR-Cas9 inizia nel 1993, quando il biologo marino Francisco Mojica, analizzando il DNA di una serie di batteri, si accorse della presenza di copie multiple e quasi identiche di una sequenza palindroma di 30 basi. Queste sequenze ripetute erano separate da tratti di DNA altrettanto caratteristici, sempre lunghi 36 basi. Fu proprio Mojica a coniare il nome CRISPR, brevi ripetizioni palindrome interspaziate in modo regolare. Il biologo si accorse che gli “spaziatori” (spacers) costituiti da 36 basi di DNA avevano la stessa sequenza di un virus che tipicamente attaccava quel batterio ma il ceppo che lui stava studiando era immune all’infezione.
Negli anni successivi, gli “avvistamenti” di CRISPR aumentarono poiché numerosi gruppi di ricerca iniziarono ad interessarsi a questa caratteristica di alcuni tipi di batteri. Studio dopo studio, era ormai chiaro che quello che avevano davanti agli occhi era un efficiente meccanismo di sistema immunitario messo in atto dai batteri contro l’attacco dei virus.
Il genoma di questi batteri oltre alle sequenze CRISPR ha una zona costituita da geni chiamati “geni Cas”, i quali codificano per la sintesi di enzimi di restrizione omonimi. La prima volta che un virus attacca il batterio, alcune proteine vanno a “tagliuzzare” il DNA virale e ne incorporano i frammenti nel genoma batterico dando l’immunità. Alla seconda infezione da parte dello stesso virus viene attivata l’espressione genica del batterio che sintetizza sia le proteine Cas sia una guida a RNA utilizzando come stampo la zona CRISPR. La guida a RNA viene suddivisa in tanti frammenti relativi ai singoli spacers e ogni pezzetto si lega a una proteina Cas. Questa “macchina molecolare” va a scandagliare il DNA virale e se lo riconosce – cioè se il DNA del virus corrisponde a una delle sequenze spaziatrici – lo taglia annullandone l’attacco.
Nel 2012 Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier pubblicano su Science un lavoro che dimostra che il sistema CRISPR-Cas9 (Cas9 è una particolare proteina Cas) può essere ricreato in laboratorio e programmato per essere indirizzato verso un preciso punto a scelta del DNA. Basta progettare una sonda a RNA a proprio piacimento di 20 oligonucleotidi complementare al tratto di interesse. Il funzionamento della tecnica si basa sull’associazione di una proteina (Cas9) con l’acido nucleico (guida a RNA). La nucleasi Cas9 viene posizionata sulla sequenza bersaglio del RNA guida e introduce un taglio a doppia elica a monte di una specifica sequenza denominata PAM che rimuove il gene di interesse. Il taglio attiva i processi di riparazione del DNA e, se nella cellula è stata introdotta la sequenza corretta del gene, la ricombinazione omologa provvederà alla correzione in modo definitivo del gene mutato.
Nel 2015, la rivista Science ha nominato CRISPR-Cas9 “scoperta dell’anno” e basta fare una ricerca su Pubmed per capire perché. Dal 2012 il numero di studi scientifici su CRISPR-Cas9 è aumentato in modo vertiginoso: nel 2016 sono stati oltre 2000 gli studi pubblicati. Le implicazioni di questa scoperta più rapida e più economica rispetto alle precedenti sono state molteplici: sono state aperte nuove vie di sperimentazione per le terapie contro il cancro e per la cura per malattie ereditarie, oltre alla possibile riparazione genetica di organi. Con CRISPR-Cas9 la ricerca si è impadronita di uno strumento che apre possibilità di applicazioni praticamente illimitate e il Nobel per la Chimica alle due ricercatrici che lo hanno messo a punto è il riconoscimento che attesta la sua potenza rivoluzionaria.