Immunoistochimica: cos’è, applicazioni e nuove metodiche

L’immunoistochimica (IHC) è una tecnica che si basa sul meccanismo antigene-anticorpo che caratterizza la risposta immunitaria. È una tecnica utilizzata nei laboratori di ricerca e clinici, che consente di rilevare la presenza di complessi antigene-anticorpo presenti all’interno di un tessuto o di una coltura cellulare. Essa sfrutta la capacità degli anticorpi di legarsi in modo specifico a determinati antigeni e consentendo in tal modo di visualizzarne la distribuzione e localizzazione nei campioni biologici.

Applicazioni dell’immunoistochimica

L’immunoistochimica è una tecnica che può essere utilizzata nei laboratori di ricerca, anatomia e patologia per lo studio, la classificazione e la localizzazione di neoplasie; per discriminare proliferazioni cellulari benigne e maligne; per identificare diverse popolazioni cellulari in uno stesso lignaggio e definirne le differenze funzionali; per ricercare fattori prognostici ed indicazioni terapeutiche non solo per neoplasie (specialmente in caso di carcinoma alla mammella e di linfomi), ma anche per altre patologie.

Procedimenti della Tecnica di Immunoistochimica

Esistono diverse varianti del protocollo dell’immunoistochimica, che possono essere utilizzati per rilevare diversi antigeni. Per la scelta del procedimento più adeguato si deve tener conto di parametri quali: il tipo di campione (sezioni di tessuto, cellule isolate o in coltura), la sensibilità del test ed il tipo di antigene che si vuole andare a marcare.

Fissazione, preparazione e processamento di preparati istologici

La fissazione è necessaria per preservare la morfologia delle cellule e mantenere le molecole antigeniche nella loro posizione originale, senza distruggerle, rendendole accessibili all’anticorpo primario. Non esiste un fissativo ottimale per tutti i tipi di antigeni, ma uno tra i più comunemente usati è la formalina tamponata neutra (NBF) al 10%, che fissa i tessuti introducendo ponti di metilene tra gli amminoacidi e tra questi ed i nucleotidi e fornisce una dettagliata rappresentazione della morfologia cellulare, consentendo anche un’immunocolorazione di alta qualità.

Dopo la fissazione, il campione istologico viene gradualmente disidratato in alcol, segue una fase di pre-inclusione a cui segue l’inclusione in paraffina ad alte temperature (60°C) e taglio al microtomo per ottenere sezioni dello spessore desiderato. Queste sezioni sono montate a loro volta su vetrini portaoggetto ricoperti di polilisina e a questo punto le sezioni dei campioni dovranno essere deparaffinate e reidratate per poter poi essere sottoposte a colorazione.

Immunoistochimica: recupero dell’antigene e blocco siti legame non specifici

Durante la fissazione con formaldeide, spesso gli epitopi che legano gli anticorpi possono venire mascherati dai legami crociati e dai ponti di metilene che si formano in molti casi, perciò può essere necessario lo smascheramento dell’epitopo per permettere una buona interpretazione dell’IHC. Due diversi metodi sono comunemente usati per il recupero dell’antigene:

• Indotto da calore (HIER: Heat Induced Epitope Retrieval): è quello maggiormente usato e comporta il riscaldamento (in autoclave, forni a microonde, piastre riscaldanti, pentole a pressione o bagni d’acqua) dei campioni in un buffer. In questo caso l’efficacia dipende dal pH del tampone usato;
• recupero enzimatico per antigeni come citocheratine e immunoglobuline: i campioni sono incubati in tripsina o proteinasi per 10-20 minuti a 37°C ed infine si aggiunge PBS (Phosphate Buffered Saline). Questo secondo metodo risulta più difficile da controllare.

Il blocco dei siti di legame non specifici è necessario per ridurre la colorazione di fondo indesiderata data dal legame aspecifico degli anticorpi con strutture proteiche e l’agente utilizzato è il 5-10% di siero normale diluito in PBS.

Aggiunta dell’anticorpo primario

Il siero viene rimosso e viene aggiunto l’anticorpo primario diluito in PBS, che deve essere adatto per il bersaglio che si vuole marcare. I campioni (sezioni o colture) sono incubati per una notte a 4°C. Quando viene scelto l’anticorpo primario da utilizzare, devono essere presi in considerazione parametri come: la funzione della proteina bersaglio, il tessuto in cui è espressa, la sua localizzazione subcellulare e le sue possibili modifiche post-traduzionali.

Aggiunta dell’anticorpo secondario e sistemi di rilevazione

Dopo aver incubato con l’anticorpo primario, vengono lavaggi in PBS e successivamente, se si sta praticando un protocollo che prevede la rilevazione indiretta, viene aggiunto l’anticorpo secondario e si ha un’incubazione di 30 minuti al buio a temperatura ambiente.

L’enzima che normalmente viene coniugato all’anticorpo secondario nel metodo indiretto è HRP (perossidasi di rafano) o AP (fosfatasi alcalina), i quali si legano ad un substrato come la DAB (3,3’-diamminobenzidina) o l’AEC (3-ammino-9-etilcarbazolo), rendendolo insolubile e facendolo precipitare sul sito di legame antigene-anticorpo, conferendo un colore marrone-ambra o rosso-blu al precipitato. I vetrini portaoggetto vengono immersi in ematossilina per permettere la contro-colorazione dei nuclei, lavati sotto acqua corrente e sottoposti a scala alcolica ascendente.

Preservazione dei campioni

Per conservare le sezioni sul vetrino portaoggetto, viene fissato su di esso un vetrino coprioggetto tramite l’uso di un agente montante, una resina che funge da collante che evita che i tessuti subiscano alterazioni nel tempo e permette la loro visualizzazione al microscopio ottico. Se l’anticorpo secondario è coniugato con un fluorocromo, molecola che ad una specifica lunghezza d’onda emette fluorescenza, i vetrini sono invece sottoposti a disidratazione e non vengono montati attraverso l’utilizzo di una resina.

Nuove metodiche dell’immunoistochimica

Recentemente, sono state sviluppate altre tecniche che migliorano la resa dell’esperimento. La tecnica a base di polimeri evita la formazione di legami aspecifici con la biotina, perciò i campioni, dopo essere stati incubati con un anticorpo primario, vengono incubati con un polimero su cui è legato l’anticorpo secondario e molti enzimi, per aumentare la sensibilità degli epitopi antigenici.

Una metodica utile per la rilevazione di antigeni presenti in basse quantità è quella nominata TSA (Tyramide Signal Amplification) o CSA (Catalyzed Signal Amplification), in cui l’anticorpo secondario è coniugato con HRP, che trasforma il substrato tirammide, marcato ad esempio con un colorante fluorescente o legato ad un aptene come la biotina, in un intermedio reattivo che si lega ai residui tirosinici delle proteine nel sito del complesso antigene-anticorpo; la reazione potrà essere visualizzata direttamente o tramite successiva incubazione con streptavidina coniugata con HRP.

A cura di Carolina Gabetta