Tecniche innovative per la diagnosi di malattie neurodegenerative
Nella malattia di Alzheimer è noto che le due proteine principali che si accumulano sono la beta-amiloide (che forma delle placche extracellulari) e la proteina tau (che si accumula a livello intraneuronale). Nella malattia di Creutzfeldt-Jakob (o morbo della mucca pazza) sono presenti accumuli di PrPSc, nella sclerosi laterale amiotrofica di TDP-43 e nel Parkinson e in alcuni parkinsonismi sono presenti aggregati di alfa-sinucleina intraneuronali o gliali in base alla patologia. Poiché queste proteine si accumulano in maniera così specifica nei cervelli dei pazienti, sono considerate come biomarcatori delle malattie neurodegenerative.
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Livelli di organizzazione proteica
Le proprietà strutturali delle proteine vengono sfruttate per lo sviluppo di tecniche biochimiche per la diagnosi di malattie neurodegenerative. Le proteine si organizzano in 4 livelli strutturali:
- Struttura primaria, ossia la struttura amminoacidica.
- Struttura secondaria, che viene acquisita in seguito alla formazione di legami che si formano tra gli amminoacidi della struttura primaria e può assumere conformazione ad alfa-elica o a beta-foglietto.
- Struttura terziaria, ossia la struttura tridimensionale che viene assunta dalla proteina.
- Struttura quaternaria, ossia la combinazione di più strutture terziarie per formare una proteina funzionale.
Un aspetto importante è che la struttura di una proteina è fondamentale per le funzioni che la proteina stessa deve esercitare e, viceversa, le funzioni di una proteina sono strettamente correlate ad una struttura proteica. Quindi è molto importante che la proteina acquisisca la struttura corretta per permettere le interazioni necessarie al funzionamento di tutto l’organismo. Per motivi ancora non noti, la struttura secondaria delle proteine coinvolte nelle malattie neurodegenerative va incontro ad un cambiamento conformazionale (misfolding) da alfa-elica a beta-foglietto.
Modello atomistico di conversione della proteina prionica
Nel modello atomistico di conversione della proteina prionica, si nota come le proteine possano andare incontro ad un riarrangiamento strutturale e la struttura alfa-elica muta in struttura beta-foglietto, senza alcuna modifica della struttura primaria. Il cambiamento strutturale di queste proteine ne determina una perdita funzionale e in alcuni casi un guadagno di caratteristiche tossiche, che possono causare patologie. Con questa conversione strutturale, l’alfa-sinucleina e la beta-amiloide espongono dei residui idrofobici che permettono alle proteine di formare degli aggregati. Queste proteine vengono chiamate proteine “misfolded” e infatti le malattie neurodegenerative vengono chiamate anche malattie da misfolding proteico.
La formazione degli aggregati nelle malattie neurodegenerative
Le proteine, una volta che subiscono cambiamento conformazionale, tendono ad aggregarsi. Il monomero con struttura ad alfa-elica, cambierà conformazione e assumerà una struttura a beta-foglietto, questi nuovi monomeri “misfolded” tenderanno a formare oligomeri e protofibrille fino ad avere delle fibrille amiloidi che si depositano nel cervello e che possono essere visualizzabili poiché sono insolubili.
Perchè è importante studiare il cambiamento conformazionale delle proteine?
Al momento la comunità scientifica si sta concentrando nello sviluppo di trattamenti che prevengano il cambiamento conformazionale e l’aggregazione di queste proteine, questo è motivato dal fatto che il processo di conversione della proteina e della successiva aggregazione delle protofibrille inizia molti anni prima (decenni prima) rispetto alla comparsa dei sintomi. È importante per l’aspetto terapeutico quindi identificare pazienti che ancora non abbiano sviluppato dei sintomi clinici perché una volta che compaiono i sintomi, nel cervello sono già presenti ammassi proteici diffusi e le terapie potrebbero non essere già più funzionali.
Le proteine “misfolded” inducono altre proteine a cambiare conformazione
Immaginiamo l’alfa-sinucleina che cambia la sua conformazione (quindi diventa “misfolded”): questo induce l’alfa-sinucleina normale a cambiare la sua conformazione. In questo modo, non solo abbiamo una perdita di funzione della proteina che cambia la sua conformazione, ma addirittura la proteina è in grado di trasmettere l’ anomalia strutturale ad altre proteine sane. Una volta che questo processo di conversione si è instaurato si amplia in modo esponenziale a livello del sistema nervoso centrale. Ciò determina un accumulo di proteine in maniera molto massiva che si localizzano preferenzialmente in specifici distretti neuroanatomici (variabili in base alla patologia considerata). È complesso quindi curare queste patologie poiché si dovrebbe agire contro una proteina che è già presente nel nostro organismo.
Come si diffondono le proteine “misfolded” una volta che si formano nel sistema nervoso centrale?
Ci sono diverse ipotesi, le proteine “misfolded” possono diffondersi:
- Mediante endocitosi
- Mediante endocitosi mediata da clatrina
- Mediante la formazione di lisosomi
- Come monomeri che fuoriescono da un neurone e che vengono “catturati” da un neurone vicino.
Ad oggi non è possibile identificare l’esatta modalità, ma quello che sappiamo è che quando i monomeri passano da un neurone all’altro sono in grado di indurre nel neurone ricevente riarrangiamenti strutturali della proteina sana.
La conformazione anomala acquisita da una proteina è responsabile di una specifica patologia. L’esempio dell’Alzheimer
La stessa proteina può assumere diverse conformazioni anomale. Il prione ad esempio è in grado di assumerne 6 e ognuna di queste è in grado di dare un fenotipo patologico della stessa malattia oppure può essere responsabile di patologie diverse.
La differenza nella deposizione delle placche di beta-amiloide indica che la malattia di Alzheimer (e altre patologie neurodegenerative) possa essere sottoclassificata in fenotipi patologici distinti. È importante riconoscere il fenotipo patologico per sviluppare delle terapie efficaci.
Ruolo dei biomarcatori liquorali nella diagnosi delle malattie neurodegenerative
Per quanto riguarda la diagnosi di queste patologie è fondamentale la determinazione dei biomarcatori e anche la caratterizzazione della loro struttura (ossia individuare la struttura anomala che induce la patologia). Purtroppo ad oggi gli accumuli delle proteine possono essere rilevati solo nel sistema nervoso centrale, quindi è necessaria l’autopsia per fare una diagnosi certa. in Italia è obbligatorio fare l’autopsia solo per un determinato tipo di malattie neurodegenerative, che sono le malattie da prioni (soprattutto la forma variante della malattia di Creutzfeldt-Jakob).
La diagnostica di queste malattie ad oggi si basa su un metodo molto classico: l’analisi dei biomarcatori liquorali. Il biomarcatore è un marcatore biologico che misura in modo preciso la presenza di una malattia, un cambiamento fisiologico, una risposta ad un trattamento.
Per quanto riguarda le malattie neurodegenerative, si preleva il liquor dei pazienti e si analizzano delle alterazioni proteiche all’interno del liquor. La diagnosi clinica di queste malattie, quando il paziente è in vita, si basa su analisi di biomarcatori surrogati (meno specifici degli accumuli di proteina) e quindi il suo livello di accuratezza non è assoluto: si formula una diagnosi di probabilità.
Analisi del liquido cefalorachidiano (CSF) per la diagnosi di malattie neurodegenerative
Per le malattie neurodegenerative il supporto principale è dato dall’analisi del liquido cefalorachidiano o liquor (CSF). Il liquor viene prodotto a livello del plesso coroideo; la quantità di liquor è in costante equilibrio fisiologico tra produzione e assorbimento e al giorno se ne producono 500 cc. Il liquido cefalorachidiano è a contatto diretto con il sistema nervoso centrale e per questo motivo le alterazioni delle proteine dovute a patologie neurodegenerative possono avere un riflesso a livello del liquor. Il liquor viene prelevato in maniera invasiva rispetto al prelievo di sangue o urine (viene inserito un ago tra la terza e quarta vertebre lombare) e successivamente viene collezionato in provette specifiche che permettono di analizzare in maniera accurata le variazioni delle proteine liquorali.
Biomarcatori periferici per la diagnosi di malattie neurodegenerative
I biomarcatori presenti nel sistema nervoso centrale possono migrare nei tessuti periferici ed essere prelevabili in modo meno invasivo rispetto al liquor. Essi possono passare da un neurone all’altro attraverso diverse vie, come quella esosomiale. È noto che gli esosomi trasportano le proteine “misfolded”, ma la concentrazione delle proteine a livello degli esosomi è davvero molto bassa, quindi le proteine non sono rilevabili.
Tuttavia, sono stati messi a punto dei protocolli per isolare gli esosomi da urina e sangue per essere analizzati. Uno dei tessuti particolari che sta prendendo importanza è la mucosa olfattiva. Il bulbo olfattivo (si trova a livello del sistema nervoso centrale) ha delle proiezioni, ossia possiede dei neuroni olfattivi che giungono alla cavità nasale. In pazienti deceduti a causa di malattie neurodegenerative è stato visto che a livello dei neuroni olfattivi della cavità nasale erano presenti degli aggregati proteici del tutto simili a quelli riscontrati nel cervello.
Tecniche diagnostiche innovative per l’identificazione di biomarcatori periferici delle malattie neurodegenerative
I neuroni olfattivi rappresentano una risorsa ottimale per lo sviluppo di tecnologie in grado di identificare eventualmente la presenza di biomarcatori specifici, non solo nella mucosa olfattiva ma anche nell’urina, sangue e liquido cefalorachidiano (infatti nelle analisi di oggi non vengono ricercati i biomarcatori specifici, ma solo i surrogati dei biomarcatori e questo è un limite per l’accuratezza diagnostica).
Oggi abbiamo a disposizione due tecnologie: la Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) e la Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC) che, sfruttando la caratteristiche del misfoding proteico, permettono di identificare a livello dei tessuti periferici la presenza di tracce di biomarcatori malattia-specifici.
Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) per la diagnosi di malattie neurodegenerative
Il meccanismo di funzionamento della PMCA è simile a quello della PCR: nel caso della PCR però viene amplificato un segmento di DNA, mentre nella PMCA vengono amplificate proteine “misfolded”. Come substrato nella PMCA si inseriscono le proteine con conformazione normale e viene sfruttata la capacità delle proteine “misfolded” presenti nei campioni biologici dei pazienti malati di convertire queste proteine. Sia la PMCA che la RT-QuIC riescono ad individuare delle tracce molto piccole dei biomarcatori malattia-specifici (nell’ordine dei femtogrammi, cioè 10-15grammi).
Grazie alla PMCA è possibile fare una diagnosi di malattia definitiva senza la necessità di eseguire un’autopsia. Addirittura è stato dimostrato che le proteine anomale sono rilevabili nel sangue 31-16 mesi prima dell’insorgenza dei sintomi. Quindi è evidente l’importanza di questo test, che permette di diagnosticare la malattia in tessuti periferici (come sangue e urina) e quindi di trattare il paziente ancora prima dell’insorgenza dei sintomi.
Rt-QuIC per la diagnosi di malattie neurodegenerative
Se nel campone biologico (urine, sangue, liquor) è presente già una traccia di proteina “misfolded” (biomarcatore di malattia), il processo della Rt-QuIC viene accelerato. Ciò innesca un cambiamento conformazionale a cascata che comporta un’accelerazione della cinetica di aggregazione della proteina anomala. Come nella PMCA arriviamo a osservare tracce di proteine nell’ordine dei femtogrammi (10-15grammi) e ad oggi non esistono ancora delle tecnologie (oltre a queste due) in grado di avere questa sensibilità.
Per la sua sensibilità e specificità, la Rt-QuIC è stata introdotta dall’Istituto Superiore di Sanità tra i criteri diagnostici delle malattie da prioni. La Rt-QuIC è utilizzata per diagnosticare la malattia di Alzheimer con una sensibililtà del 90% e specificità del 92%. Ad oggi la tecnologia Rt-QuIC è utilizzata anche per altre malattie, come la demenza fronto-temporale; per questa malattia la tecnica è in grado di individuare la proteina tau “misfolded” con una sensibilità e specificità del 100%.
Analisi Rt-QuIC della mucosa olfattiva prelevata da pazienti con malattia di Parkinson
È stata sviluppata una metodologia che ha permesso di migliorare ulteriormente la sensibilità della Rt-QuIC: ora è in grado di rilevare anche gli attogrammi (10-18grammi) di alfa-sinucleina presenti in un campione. L’aspetto fondamentale è che sia il Parkinson che l’atrofia muscolare sistemica sono causati da accumuli di alfa-sinucleina “misfolded” in strutture diverse (nell’atrofia multisistemica nelle cellule gliali, nel Parkinson nelle cellule neuronali con la formazione di corpi di Lewy) e questa tecnologia permetterà di distinguere le due patologie.
L’anosmia nel Parkinson
Il morbo di Parkinson nell’ 80% dei pazienti esordisce con un’anosmia che compare 5- 10 anni prima e questo indica una compromissione in atto sia dei neuroni della mucosa olfattiva, ma anche di tutto il sistema del bulbo olfattivo. Inoltre è emerso che la tecnologia Rt-QuIC permette di discriminare due fenotipi distinti di atrofia multisistemica, quindi due fenotipi patologici diversi della stessa malattia. Ciò è molto importante dal punto di vista terapeutico per massimizzare gli effetti benefici del trattamento e in questo modo si può evitare di sottoporre i pazienti mal classificati a trattamenti inutili.
Il ruolo del sistema glinfatico nelle malattie neurodegenerative
Il cervello è circondato dal liquor (o liquido cefalorachidiano) che funziona come “spazzino” del cervello. Il liquor rimuove proteine tossiche come tau, beta-amiloide e alfa-sinucleina che si accumulano durante l’invecchiamento e questa attività è massima durante il sonno. Alterazioni del sistema glinfatico possono contribuire notevolmente all’insorgenza di malattie neurodegenerative (come si vede in foto). Inoltre è stato visto effettivamente che nelle hostess o comunque nelle persone che hanno delle alterazioni del ritmo del sonno c’è un incidenza maggiore di patologie neurologiche e neurodegenerative.